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1．人中性粒細胞的細胞內(nèi)pH測定

1）. 試劑

·中性粒細胞 （從人血液中提取）

·HEPES緩沖液

（153 mmol/l NaCl, 5 mmol/l KCl, 5 mmol/l 葡萄糖, 20 mmol/l HEPES, pH 7.4）

·BCECF-AM special packaging

·標(biāo)定用緩沖液

（130 mmol/l KCl, 10 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgSO₄, 10 mmol/l Na-MOPS）

·Nigericin

2）. 染色及測定方法

a. 用HEPES制備細胞懸液，細胞濃度為4×10e7個/ml。

b. 加入1 mmol/l的BCECF-AM溶液，終濃度為3 µmol/l，在37℃下孵育30分鐘。

c. 用HEPES緩沖液充分清洗細胞外的BCECF-AM和凝集的中性粒細胞。

d. 用緩沖液將BCECF染色的細胞制成3×10e7個/ml的細胞懸液。

e. 取適量的細胞懸液，細胞數(shù)量為3×10e6個/ml，用熒光光度計測定熒光 （激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長530 nm）。

f. 在37℃下孵育10分鐘后，添加刺激藥物，記錄熒光強度的變化。

3）.標(biāo)準(zhǔn)曲線

a. 準(zhǔn)確配制標(biāo)定用緩沖液 （例如pH值：6.6、7.0、7.2、7.4、7.8、8.2 ）。

b. 從細胞懸液中取3×10e6個/ml細胞，離心清洗后用1 ml標(biāo)定緩沖液混合，制成細胞懸液。

c. 加入nigericin終濃度為10 µg/ml，孵育約10分鐘后，測定熒光強度。

d. 橫軸為緩沖液的pH值，縱軸為熒光強度作圖。

2．注意事項

a. 若BCECF很難轉(zhuǎn)入細胞，可以同Fura 2一樣，用Pluronic F-127等表面活性劑。

b. 關(guān)于兩個激發(fā)波長，詳見參考文獻1）和5）。

c. 請先將nigericin用乙醇配制成2 mg/ml的儲備液。

關(guān)于細胞凋亡熒光染料Hoechst 33342 /PI 雙染 （2010-8-5）

關(guān)于Hoechst 33342

一、原理

正常情況下，熒光染料 Hoechst 33342 只有少量能透過細胞膜進入細胞，使其染上低藍色。但是當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，它的細胞膜通透性增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342 比正常細胞的多，熒光強度要比正常細胞中要高。此外，凋亡細胞的染色體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而使該染料能更有效地與DNA 結(jié)合，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342 排出到細胞外使之在細胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強。

二、激發(fā)波長和儀器

使用帶有350nm激發(fā)波長和460nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細胞。

三、毒性

Hoechst 33342對人體有害，請注意適當(dāng)防護，操作時要十分小心，注意穿實驗服并戴一次性手套。

四、操作

1．對于固定的細胞或組織：
（1）對于細胞或組織樣品，固定后，適當(dāng)洗滌去除固定劑。隨后如果需要進行免疫熒光染色，則先進行免疫熒光染色，染色完畢后再按后續(xù)步驟進行Hoechst 33342染色。如果不需要進行其它染色，則直接進行后續(xù)的Hoechst 33342染色。
（2）對于貼壁細胞或組織切片，加入少量Hoechst 33342染色液，覆蓋住樣品即可。對于懸浮細胞，至少加入待測染色樣品體積3倍的染色液，混勻。室溫放置3-5分鐘。
（3）吸除Hoechst 33342染色液，用TBST、PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。
（4）直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細胞發(fā)生凋亡時，會看到凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。
2。對于活細胞或組織：
（1） 加入適當(dāng)量Hoechst 33342染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于六孔板一個孔需加入1ml染色液，對于96孔板一個孔需加入100微升染色液。
（2）在適宜于細胞培養(yǎng)的溫度培養(yǎng)10-20分鐘。棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌2-3次即可進行熒光檢測。

五、注意事項

（1）Hoechst 33342染色后的熒光會有淬滅現(xiàn)象，所以建議染色后在當(dāng)天完成檢測，放置時間不宜過長。

（2）一般情況下，Hoechst 33342染料的濃度推薦為10-50μM。

六、同仁化學(xué)Hoechst 33342的優(yōu)點

（1）配制好的容液，減少操作步驟，減小對人體危害。該產(chǎn)品相對DAPI致癌性更小一下。

（2）可以和PI一起用于細胞凋亡檢測，染色后可看出細胞凋亡情況：正常細胞為低藍色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細胞為低藍色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。

（3）對于活細胞，33342比33258穿透膜的能力更強一些。

（4）小包裝適用于老師做量小的實驗，不會造成試劑浪費。